[一种高效而经济获得长片段基因突变体的方法]非基因片段突变是基因突变吗
摘要。重组pcr方法的发展为体外突变技术提供了更快捷、准确的方法。通过改进引物设计和pcr保真性等方法，应用重叠延伸pcr的原理成功地实现了对ba基因的定点突变，并构建了其含有m1，m2，m3和m4的突变体。实验证明通过这种改进方法可以有效地进行长片段基因的突变，并且这种方法与其他方法相比具有简便、快捷、经济、高效的特点。
关键词：定点突变；重叠延伸pcr（oepcr）；基因
中图分类号：q785
文献标识码：a
文章编号：1007―7847（2006）01―0034―05
体外定点突变技术是研究基因、蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是实验室中改造或优化基因常用的手段。缺失、插入或替换特定碱基的定点突变可用不同的方法来实现。目前已报道的以pcr为基础的各种诱变方法中，“重叠延伸法”和“大引物法”比较突出，在此基础上发展的“一步pcr方法”也有一定的应用范围。这些方法虽然都有各自的优点，但其诱变率却不理想。
本研究中突变的基因（ba）长度较大（3，0kb），我们拟将它的4个丝氨酸（ser）位点（m1，m2，m3和m4）通过碱基置换变为编码丙氨酸（aia）的位点，预突变的位置都位于基因中后段，综合这些特点，本研究通过改进引物设计和pcr保真性等方法应用重叠延伸pcr（overlapexten-sionpcr，oepcr）原理实现了对ba基因的定点突变并构建了突变体。实验证明了此种改良方法简便、快捷、经济而又突变准确，尤其适用于长片段基因的定点突变。
1材料和方法
1.1材料
t4dna连接酶购自neb公司，t4dna聚合酶，限制性内切酶kpni、xhoi与dntps及凝胶纯化回收试剂盒（dv805a）均购自takara公司，引物合成于takara公司，pfuultratmdna高保真聚合酶购自stratagene公司，potb7-ba质粒，克隆载体pcdna3，1hisa购自lnvitrogen公司。
1.2方法
自行设计的在ba基因开放阅读框两端的引物pa／pb，通过分别引入限制性酶切位点kpni和xhoi可将其导人载体pcdna3.1hisa.引物如下：
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