菌种筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用mrs琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，sl培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用gyp培养基，链球菌有tyc培养基、ms培养基。m17培养基被用作乳球菌的分离培养基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在mrs培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一、筛选方法：

1.溶钙圈法：

利用一些产酸类细菌在含caco3的培养基上产生caco3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入caco3的作用是。①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的ph。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

148h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在mrs培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。

2.溴甲酚绿指示剂法：

培养基：mrs培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）

筛选过程。同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。

二、菌种的分离筛选1.培养基：

★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10bx）1l预先灭菌碳酸钙5-10g/lph自然（分离用）

★★1.2牛肉膏10g/l蛋白胨10g/l酵母膏10g/l番茄汁200g/l葡萄糖10g/l吐温0.05%caco315-20g/l溴甲酚绿0.01%ph6.0-6.5（分离用）★1.3番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏7.5g/l葡萄糖10g/l番茄汁100ml蛋白胨7.5g/lkh2po42.0g/l吐温0.5mlph6.0-6.5（分离用）1.4葡萄糖20g/l酵母膏10g/lph6.0-6.51.5蛋白胨8-10g/l酵母膏3-5g/l葡萄糖13-15g/lkh2po41.5-2.0g/lmgso40.3-0.5g/lmnso40.2-0.25g/lnaac3.0-5.0g/lph5.5-6.51.6蛋白胨0.8-1.0g/l糖蜜3.0-5.0g/l酵母膏3-5g/l玉米浆0.5-1.0g/lkh2po40.1-0.3g/lmgso40.3-0.5g/lnac13-5g/l葡萄糖8-10g/lph5.5-6.5（发酵或种子培养基）★★1.7mrs培养基（分离培养计数用）