western blot失败经验总结

第一篇。westernblot失败经验总结westernblot失败经验总结1我做了很久的wb，最大的一个难点感觉在于样品制备上。蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做wb的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loadingbuffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadingbuffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。

另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于wb的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ecl法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做wb之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。

最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。

westernblot失败经验总结2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会

1、跑胶电泳buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；

2、转膜我用的是湿转，buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过pvdf膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。

ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴＴＩＮＧ心得

１.总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：

组织匀浆后，15000g，4度，20分钟后，取上清.buffer：np40750ul，脱氧胆酸钠0.5克，sds0.1克，加1*pbs至100ml.再加入pmsf（7.4mg/ml）0.1ml.（现用现加）7.4mg/mlpmsp异丙醇溶液：取amgpmsf加a/7.4ml异丙醇.工厂-20度储存２.组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行

（1）取组织，用pbs冲洗干净组织上的血液.加入10mlbuffera，用剪刀尽可能剪碎组织，于冰上充分匀浆。每次30秒，重复3-5次.（2）离心机1000rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。（去掉大块组织及结缔组织）（3）100000g，4℃离心1hr，弃去上清.（此为胞浆蛋白，若只提取胞浆蛋白，可用10000rpm，4度，30分钟离心，取上清即可）。沉淀用适量的bufferb重悬，4度过夜后，分装至ep管，eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。（4）收集所得上清液即为膜组份。