染色质免疫共沉淀

准备工作：

预冷pbs，ripabuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机

1.用预冷的pbs洗涤细胞两次，最后一次吸干pbs；

2.加入预冷的ripabuffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）

3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5ep管中，4℃，缓慢晃动15min（ep管插冰上，置水平摇床上）

4.4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中

5.准备proteinaagarose，用pbs洗两遍珠子，然后用pbs配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6.每1ml总蛋白中加入100μlproteina琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（ep管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景

7.4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除proteina珠子

8.（bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）

9.用pbs将总蛋白稀释到约1μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10μg/μl）

10.加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异

11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育

12.加入100μlproteina琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl“过渡抗体”（兔抗鼠igg，兔抗鸡igg）

13.14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的ripabuffer洗3遍，800μl/遍，ripabuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用pbs

14.用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60μl足够上三道）

15.将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

ripabuffer配制：

基础成分：

tris-hcl（缓冲液成分，防止蛋白变性）

nacl（盐份，防止非特异蛋白聚集）

np-40（非离子去污剂，提取蛋白；用h2o配制成10%储存液）

去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用h2o配制成10%储存液；避光保存）

注意。准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

ripa蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟（pmsf）（用异丙醇配制成200mm的储存液，室温保存）

edta（钙螯合剂；用h2o配制成100mm的储存液，ph7.4）

亮抑酶肽（leupeptin）（用h2o配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）

抑蛋白酶肽（aprotinin）（用h2o配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）ripa磷酸（酯）酶抑制剂

激活的na3vo4（用h2o配制成200mm的储存液，见sodiumorthovanadateactivationprotoco）