重组质粒的构建经验~~~

一、克隆基因的酶切位点问题

1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。

2、保护碱基数目的问题。在设计pcr引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合dna片段上。如ndei就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的hindiii也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。ncoi4ndei6nhei3noti8pmei6saci3sali3smai3hindiii3bsti8sphi4xhoi3xbai3smai4案例分析一：本人最初曾选用ndei克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计pcr引物时，引入ndei酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在，在ndei序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。

二、载体酶切的问题

1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，这些问题都是要核实的。因此，在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前，对所选择的克隆位点都要作一一鉴定，例如选择ndei和hindiii作为克隆位点，就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后，再发出引物合成定单，进行引物合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。

2、连接反应的对照。在实验中，这步骤属于质粒载体与外源dna片段的连接反应。成功与否，很大程度上取决于与质粒和dna片段的酶切效果。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样，这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在，这样，在连接反应中，即使在外源dna片段存在下，这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中，在不加入外源片段情况下，实验结果如果有菌斑生长，说明双酶切不充分，质粒dna必须重新进行双酶切。实验案例分析2：本人曾用xhoi和hindiii酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现xhoi酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。实验案例分析3：本实验室一个号称实验严谨的大博士，用kpni和hindiii构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑kpni酶失效。迁怒kpni，在我不知情下扔掉实验室所有kpni酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，后经鉴定hindiii位点失效。最后他责备本人暗中保留一手，没