重组质粒的构建经验~~~
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析,列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点,所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识,不赘述。
2、保护碱基数目的问题。在设计pcr引物时,引入酶切位点后,常常要加入保护碱基,这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少,可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下,普通的内切酶只加入两个保护碱基,其内切反应就可以正常进行;而有一类,仅仅只加入两个保护碱基,其内切反应就不能正常进行,这是因为内切酶不能正常结合dna片段上。如ndei就属这类,需要加入至少6个保护碱基,常用的hindiii也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数,相信下列将有助于大这家的实验设计。ncoi4ndei6nhei3noti8pmei6saci3sali3smai3hindiii3bsti8sphi4xhoi3xbai3smai4案例分析一:本人最初曾选用ndei克隆位点,未注意到保护碱基数目的问题,设计pcr引物时,引入ndei酶切位点后,只加上两个保护碱基,一个月内没有进展,始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在,在ndei序列后加上六个保护碱基后,迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了,为保证酶切充分,连接顺利,不用节约那点钱,再说若一次不成功,重复实验花费时间与金钱更多,孰利孰弊,不言自明。呵呵。
二、载体酶切的问题
1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单,但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的,其中的各酶切位点状况如何,是否能被有效地切开,这些问题都是要核实的。因此,在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。现在我每次构建之前,对所选择的克隆位点都要作一一鉴定,例如选择ndei和hindiii作为克隆位点,就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后,再发出引物合成定单,进行引物合成;若不能,就按“一”中原则进行调换。
2、连接反应的对照。在实验中,这步骤属于质粒载体与外源dna片段的连接反应。成功与否,很大程度上取决于与质粒和dna片段的酶切效果。一般情况下,都在通用缓冲液中进行双酶切,但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样,这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在,这样,在连接反应中,即使在外源dna片段存在下,这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中,在不加入外源片段情况下,实验结果如果有菌斑生长,说明双酶切不充分,质粒dna必须重新进行双酶切。实验案例分析2:本人曾用xhoi和hindiii酶切位点构建重组质粒,对质粒进行双酶切后,直接就做连接,未上述两步鉴定,每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后,发现xhoi酶切位点损坏。又是一个月没有进展,浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到:单切质粒是一条带,双切质粒也是一条带,电泳行为上是一样的,分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿,呵呵。实验案例分析3:本实验室一个号称实验严谨的大博士,用kpni和hindiii构建重组质粒,一个月未果,只得阴性斑,不得阳性斑,后怀疑kpni酶失效。迁怒kpni,在我不知情下扔掉实验室所有kpni酶。我得知后,问他做过上述两鉴定实验后,他支吾着说没有,后经鉴定hindiii位点失效。最后他责备本人暗中保留一手,没
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